最近又重新开始做免疫组织化学了，虽然前几年都在做，但是每次都是提心吊胆，有时候担心抗体会不会有问题，有时候担心孵育时间，有时候又担心片子自身的问题。sigh，说真的，做实验真的非常不容易啊！
神经细胞的免疫组织化学技术
一、【实验目的要求】
本实验的目的是，学习神经免疫组织化学与细胞化学技术。通过本实验要求，掌握免疫组织化学与细胞化学技术的基本原理，熟悉基本操作过程与技术关键，了解免疫组织化学与细胞化学技术在神经科学研究中的使用概况。
二、【实验原理】
免疫组织化学是利用免疫学的抗原与抗体可特异结合的原理，和组织化学技术相结合，对组织、细胞特定抗原（或抗体）进行定性、定位和定量研究的技术。
免疫组织化学技术能在细胞、染色体或亚细胞水平，检测原位的抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的，它能够在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成新的检测系统，为神经生物学、医学等各个领域分子水平的研究与诊断开拓了广阔的前景。
由于抗原与抗体的结合具有很高的特异性，致使本法具有高度的特异性、灵敏性和精确性。凡是能作抗原、半抗原的物质（如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等）都可用相应的特异性抗体，在组织、细胞内，用免疫组织化学手段检测和研究。在神经科学研究中广泛应用于神经肽、酶、受体等的组织、细胞的定性、定位和定量观测。值得注意的是，抗体只能识别特定的抗原决定簇，而不能识别抗原本身，所得结果并不直接表示神经肽、酶蛋白、受体蛋白等抗原的真实含量，实际上只能反映抗原决定簇（抗原决定簇是由暴露于表面的空间上相邻的3~8个氨基酸组成）的含量。因一个抗原上可有多个抗原决定簇，抗血清中可能含有不同决定簇的抗体，常称为多克隆（polyclonal）抗体。为提高抗体的针对性、特异性、降低交叉反应，可用杂交瘤技术制备单克隆（monoclonal）抗体。
为要显示在组织和细胞进行的抗原-抗体反应、常用标记抗体，进一步用组织化学的方法显示标记物，用显微镜观察标记物。常用的组织化学方法有：①直接法——将标记物直接标记在特异性第一抗体上，直接显示抗原-抗体复合物；②间接法——并不直接标记第一抗体，而是把标记物标记在第二抗体或PAP/ABC复合物上，间接显示抗原；在免疫组织细胞化学中常用的标记物有，荧光素、酶、铁蛋白、生物素、金及放射性核素，目前，光镜免疫组织化学最常用的方法是，①辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase anti-peroxidase method，PAP法），②卵白素（抗生物素）-生物素-过氧化物酶的ABC（avidin-biotin-peroxidase complex）法，③免疫荧光组织化学法。
目前做比较多的是第三种，免疫荧光组织化学。正在做的是第二种，曾经做过第一种。昨天做了一天却没有结果，郁闷之余，不禁很想知道操作过程中，究竟是那一步出了问题？
⒈ PAP法
PAP法是一种间接免疫-酶法，该法是利用PAP复合物作为酶标——特异显色基团、显示被检测物质的组织化学方法，因简化了操作步骤，提高了灵敏度，是目前免疫组织化学染色中常用的方法。
PAP复合物是HRP（辣根过氧化物酶）的抗体和HRP结合而生成的一种复合物，它含有2个抗HRP的IgG分子及3个HRP分子。
PAP法需用三级物质：①特异的第一级抗体（多为兔或小鼠IgG），②第二级抗体——桥抗，是抗第一级抗体（IgG）的抗体（如羊抗兔IgG或驴抗小鼠IgG），作为联接第一级和第三级抗体的桥梁，特称为桥抗，③第三级——PAP复合物。桥抗IgG分子有两个Fab段，一个与第一级抗体结合，另一个与PAP复合物结合，桥抗的两个Fab段是相同的，因此第一抗体及第三级PAP复合物必须来自同一种动物。
最后用HRP的底物(DAB)，来显示PAP复合物。
呈色反应：HRP在H2O2存在下，能使底物氧化并生成不溶性棕褐色沉淀物，定位在抗原所在处。
最常用的HRP底物是：①二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB），氧化后的反应产物为稳定的棕色沉淀，DAB是主要的显色剂（DAB致癌作用较强，使用时要小心，不要接触皮肤）；②四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetrametylbenzidine，TMB），其氧化产物为深蓝色至蓝黑色颗粒；TMB的显色作用比DAB灵敏，且无致癌作用，但TMB的反应产物不稳定，易褪色消失，一般用作HRP示踪法的底物。
实验
一、【常用的实验仪器设备】
恒冷箱切片机，37℃恒温箱，低温冰箱，4℃冰箱，显微镜，彩色图象分析系统，200及20μl可调微量加样器。
二、【主要试剂及其配制】
〔特殊试剂〕
⒈ 第一级抗体：根据欲测物质的不同，选用该物质制备的相应抗体，如欲显示SP、ENK则选用相应的兔抗SP、兔抗ENK。
⒉ 第二级抗体：根据第一级抗体的来源选择第二级抗体，如第一级抗体来源于兔，第二级抗体应选用羊抗兔IgG。
⒊ 兔PAP复合物：必须与第一级抗体来源相同。
所用抗体均需小量分装，低温保存，避免反复冻融。用时以0．01mol/L PBS稀释成工作浓度（最佳实验浓度）——抗体稀释度，可根据各抗体的效价而定。
〔一般试剂〕
⒈ Millonig’s多聚甲醛固定液（pH 7.4）的配制
A液：多聚甲醛 40 g
双蒸水 400 ml
置于60℃水浴中，滴加10 N NaOH溶液（约10滴），振摇至全部溶解，冷却。
B液：NaH2PO4•2H2O 16.88 g
双蒸水 300 ml
C液：NaOH 3.86 g
双蒸水 200 ml
将B液加入C液混合后，加入A液，调pH至7.4，加水至总量1000 ml，4℃贮存备用（此液尽可能新鲜配制）。
⒉ 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 （PBS，pH7.4）
1） 0.2mol/L 磷酸缓冲液（PB）储备液
A液：Na2HPO4•12H2O 57.30 g
双蒸水 800 ml
B液：NaH2PO4•2H2O 6.24 g
双蒸水 200 ml
A+B混合，调pH至7.4，即为0.2M PB，备用。
2） 0.01 mol/L PBS
0.2 mol/L PB 100 ml
NaCl 17 g
双蒸水加至 2000 ml
⒊ 0.25% Triton X-100液
Triton X-100（加温熔化） 0.75 ml
0.01M PBS(pH7.4)加至 300 ml
⒋ 20%蔗糖缓冲液
蔗糖 20 g
0.1 mol/L PB加至 100 ml
5.显色液（0.05% DAB，0.01% H2O2，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液）
1) 0.5 mol/L Tris-HCl储备液
Tris 6.057 g
双蒸水 50 ml
以1N NaOH调pH至7.6，再加双蒸水至总量100 ml，棕色瓶储存，4℃保存。临用时稀释10倍配成0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液。
2) 显色液
DAB 5 mg
0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液 10 ml
30% H2O2 3.4μl 共同混匀，立即使用。
四、【操作步骤】
⒈ 标本的制备
⑴动物经腹腔注射10%水合氯醛（0.6 ml/200 g）麻醉。
⑵开胸，剪开左心室，将平口针头插至升主动脉，结扎紧，剪开右心耳。
⑶先用温的生理盐水200 ml灌注，冲洗血液至液体清亮。
⑷灌注4%Millonig’s多聚甲醛液400 ml。
⑸取脑、脊髓或所需标本，削块，置于相同固定液中4℃固定1～2d。不过我一般不后固定，直接入梯度蔗糖10%-20%-30%
⒉ 切片
⑴将组织移至20%蔗糖磷酸缓冲液内过夜（40C），待组织下沉后即可切片。
⑵用0.01 mol/L PBS冲洗后入恒冷箱内冰冻，切片厚度15～20μm。切片收集于0.01 mol/L PBS中，漂洗5 min×2次。
⒊ 免疫组织化学染色程序
⑴切片入0.25% Triton X-100溶液中（37℃，30 min）。PBS漂洗（5 min×2次）。
⑵切片入3%正常牛血清蛋白中（37℃，30 min）。也就是封闭，选择与二抗来源相同的血清，封闭非特异性蛋白。
⑶切片入第一级抗体，37℃保温（3 h），移至4℃冰箱（保湿、48～60 h） ，PBS漂洗（10 min×3次）。我们一般直接放4度冰箱60-72小时。
⑷切片移至羊抗兔IgG（1：200）溶液（37℃，45 min）。PBS漂洗（10 min×3次）。
⑸切片入PAP复合物（1：400）溶液（37℃，45 min）。PBS漂洗（10 min×3次）。
⑹切片入显色液内室温显色（2～3 min）后，立即漂洗（10 min×3次）。
⑺贴于洁净载玻片上，室温凉干，逐级酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片。
⒋ 显微镜观察： 免疫组织化学阳性免疫反应产物呈深棕色颗粒，沉淀在抗原所在部位。
五、【免疫组织化学对照实验】
为确定免疫反应特异性，必须进行对照实验。
⒈ 抗体吸收试验：将足量的抗原如SP加入抗SP血清孵育、离心、取上清液作为第一抗体，结果应为阴性。
⒉ 空白对照：用0.05 mol/L PBS 代替第一抗体，其余步骤不变。
⒊ 替换试验：用正常血清代替第一抗体，其余步骤不变。结果应为阴性。
六、【注意事项】
1．动物在灌流过程中，必须快速冲洗血液，防止血液凝固而影响固定和背景显色。
2．蔗糖应将组织浸透，必须有足够的时间。
3．各级抗体均须在低温冰箱保存，为避免反复冻融所造成的抗体效价的降低，应将抗体稀释成适当浓度，小量分装。
⒋ 第一抗体的浓度（效价）是关键。因此，该实验中应设计一系列第一抗体浓度梯度比，从而找出最佳反应浓度。标准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色。
5．组织切片厚时，第一抗体不易穿入，Triton孵育时间应相应延长。反之，切片薄时，Triton孵育过长，则组织易破损。
⒍ 为了尽量减少着色背景，最好用牛血清白蛋白来稀释抗体。
7．切片漂洗必须彻底、干净。PBS漂洗不足，背景含有非特异性染色。PBS漂洗过度，易造成假阴性结果。
8．显色液必须新鲜配制，配后立即使用。显色时间不能超过5 min，否则产生较深的背景，不利于观察，甚至出现假阳性。
9．由于在外周组织中含有大量的内源性过氧化物酶，故在用外周组织进行研究时需常规使用甲醇-双氧水溶液处理（37℃，45 min），其配制如下：
双蒸水 4.5 ml
30%H2O2 0.5 ml
甲醇 20 ml
10．DAB为强烈的致癌物质，使用时必须小心操作，避免接触皮肤。
⒉ ABC法
ABC法与PAP法相似，虽也是间接免疫-酶法，但却以ABC复合物反应代替PAP复合物反应。ABC是卵白素（抗生物素）-生物素结合的HRP复合物（avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex）的简称。生物素（biotin）是一个小分子维生素，易与很多生物分子交联；生物素可与HRP结合。卵白素（avidin）是一种存在于蛋清中的糖蛋白，其每一个分子上有4个同生物素亲和力极高的结合位点，可与带HRP的生物素结合，进而形成带HRP的ABC复合物。
ABC法选用已结合生物素的抗IgG抗体做桥抗——生物素标记的第二抗体（此第二抗体必须是针对第一抗体种属性的），ABC复合物与桥抗之间是通过生物素结合，故没有种族特异性，适用于任何种类的第一抗体。ABC法比PAP法具有操作时间短，灵敏度更高等优点。
一、【主要试剂】
〔特殊试剂〕 第一抗体及ABC试剂盒
（1）第一级抗体：根据欲测物质的不同，选用该物质制备的相应抗体，如欲显示SP、ENK则选用相应的兔抗SP、兔抗ENK。
（2）ABC试剂盒：包括
A：封闭用羊血清
B：生物素（标记）羊抗兔IgG
C：ABC复合物
国内各生物制剂公司均有相应的ABC试剂盒供应，非常方便，有浓缩型和即用型。其浓缩型抗体提供的工作浓度，用时以0.01mol/L PBS稀释；而即用型则在用时直接孵育切片，不必稀释。
〔一般试剂及其配制方法〕
均同PAP法（请参看PAP法）
二、【实验操作步骤的特点】
由于ABC法同PAP法一样，都是间接免疫反应的三步法，其操作步骤均同PAP法，所不同的仅是二抗和ABC复合物。故在操作时仅需用生物素化的羊抗兔IgG代替PAP法步骤中的羊抗兔IgG，并ABC复合物代替步骤中的PAP复合物。另外，由于ABC法灵敏度较PAP更高，各抗体孵育的时间在实际操作过程中可适当缩短，故ABC法是目前更常用的免疫组织化学方法。
⒊ 免疫荧光法
利用荧光素标记抗体（抗原）作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原（抗体），在荧光显微镜下对抗原（带有荧光素的抗体-抗原复合物）进行定位、定性、定量观测。
常用的荧光素有：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC，在荧光显微镜下呈黄绿色荧光），罗达明（rhodamine，TRITC，在荧光显微镜下呈橙红色荧光）。
用荧光素直接标记第一抗体的方法虽有方法简单、特异性强、需时短的优点，但也有灵敏度低，必须分别标记每一种抗体，且需要量大等缺点，现几乎无人使用。现多将荧光素标记在第二或第三抗体上，作间接显示。间接法比直接法敏感，且只需标记一种抗IgG抗体就可鉴定多种抗原。
【原理】
¨ 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
¨ 荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
¨ 借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
¨ (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
¨ (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
¨ (3) 四乙基罗丹明 (RB200)
¨ (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
¨ 易溶于水和乙醇。
¨ 最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量 389.4。
¨ 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
¨ 最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
¨ 与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
¨ 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
¨ 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
¨ RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸e-氨基反应而标记在蛋白分子上。 (4) 碘化丙啶(PI)
¨ 是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
¨ PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
¨ 最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
¨ 一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
– 一般认为0～4°C可保存1～2年，-20°C可保存3～4年。
– 要小量分装，防止反复冻融。
– 保存前需加防腐剂 (浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠) 。
3、免疫荧光的染色方法
¨ 免疫荧光染色法常用的有
– 直接法
– 间接法
原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。
直接免疫荧光法的操作步骤
¨ 标本的处理：
– 细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次；
– 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；
¨ 2%BSA或10%BSA37℃湿盒内封闭30min
¨ 抗体染色：
– 在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37℃孵育30min；
¨ 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
¨ 缓冲甘油封片
– 分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
¨ 镜检：在荧光显微镜下观察。
¨ 优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
¨ 缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项
¨ 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
¨ 一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
¨ 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
– 染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
– 染色温度：多采用室温(25℃)，高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
– 低温染色过夜较37 ℃ 30 min效果好的多。
¨ 试验时需设置下列对照：
– 自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
– 阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
– 特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
¨ 若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
¨ 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
¨ 经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法
需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
– 可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
间接免疫荧光法操作步骤
¨ 标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
¨ 一抗染色：
– 加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37℃作用30min或4℃过夜。
¨ 0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)；
¨ 加荧光标记的二抗抗体，37℃湿盒避光作用30min。
¨ 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
¨ 甘油缓冲液封片
¨ 镜检
¨ 优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
¨ 缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。
间接免疫荧光法的注意事项
¨ 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
¨ 每次试验时 ，需设置以下三种对照：
– 阳性对照：阳性血清+荧光标记物
– 阴性对照：阴性血清+荧光标记物
– 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
¨ 标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
¨ 一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
神经组织细胞的多重标记技术
一、【基本原理】
脑的构成细胞多样、相互联系广泛且机能复杂，如何能在同一张切片上同时显示在不同机能条件下各种细胞（神经元、胶质细胞等）的形态学特点、所含物质以及各细胞间相互关系等，是神经形态学的一个重要方法问题。本实验室成功地将免疫组织化学染色法、逆（顺）行示踪法和组织化学染色法有机地结合起来，建立了各种多重标记法（二重、三重或四重标记法），较好地解决了上述问题。现以四重标记法作为例子进行介绍。
四重标记可将不同显色的免疫组织化学标记法与神经元逆行示踪法相结合，同时显示神经元或神经胶质细胞内所含蛋白、肽或氨基酸和用组织化学法显示逆行示踪剂在胞浆中的表达。
轴浆运输示踪法是目前应用最广者的束路示踪法。轴浆运输是某些物质通过轴浆流进行运送。从胞体至末梢的运输为顺向运输，反之从末梢至胞体者为逆向运输。常用的轴浆运输示踪剂有辣根过氧化物酶（HRP）、荧光染料（荧光金等）、植物凝集素（麦芽凝集素WGA、菜豆芽凝集素PHA-L）及霍乱霉素（CT）等，它们在胞体或末梢内形成标记物。
免疫组织化学染色是用抗原与抗体能特异性结合的原理，以神经元或神经胶质内所含的蛋白、肽或氨基酸为抗原，用特异性的抗体去识别并与之结合，再用不同的方法使之可视化。常用的有间接荧光法和酶免疫法（ABC法和PAP法）。ABC法是在第一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgG抗体（biotinylated IgG）桥接。然后用ABC复合物孵育，使桥抗上的生物素与ABC中卵白素上的空位结合。最后用HRP的底物呈色。在ABC法中，ABC和桥抗的结合是通过生物素的，因此ABC复合物没有种属特异性，可适用于任何种类的第一抗体。但生物素结合的第二抗体必须是针对第一抗体种属的。PAP法与ABC法相似，都是借助桥抗体将酶连接在与抗原结合的第一抗体上，用PAP复合物孵育切片。
下述的四重标记法可分别显示如胶质原纤维酸性蛋白（GFAP，特异性标记星形胶质细胞），Fos蛋白（标记活动状态的细胞核），某种神经递质或调质及其相关的酶（如酪氨酸羟化酶TH）均匀标记在胞浆内；逆行追踪剂在胞浆内的定位。由于用不同的显色方法呈色，加之反应产物定位于不同细胞或细胞的不同部位（核、胞浆），因此在镜下易于分辨。
二、【实验材料】
〔仪器设备〕
⒈ 组织切片机：冰冻切片机（立、卧式恒冷箱切片机），滑动切片机和二氧化碳制冷切片机，振动切片机。
⒉ 立体定位仪：
⒊ 微量注射器：
⒋ 实验室基本器材和用具：烧杯，量筒，漏斗，湿盒，晾片盒，蒸馏水瓶，漏斗架，药匙，滤纸，玻璃棒，洗刷瓶，染色缸，染色架，载玻片和盖玻片等。
⒌ 常用器械和工具：解剖刀，手术剪，眼科镊和剪，有齿及无齿镊子，单、双面刀片，普通剪刀，螺丝刀，老虎钳，扳手等。
〔药品〕
⒈毒麻药品：巴比妥钠，戊巴比妥，乙醚等。
⒉常用化学试剂：多聚甲醛，磷酸二氢钾，蔗糖，氯化钠，磷酸二氢钠，氢氧化钠，磷酸氢二钠，盐酸，无水乙醇，二甲苯，丙酮，甲醇，重铬酸钾，葡萄糖，氯化铵，甘油，双氧水等。
〔试剂〕
⒈ 第一抗体：兔抗Fos蛋白抗血清， 鼠抗GFAP抗血清和兔（或鼠）抗TH抗血清等。
⒉ 第二抗体：羊抗兔，驴抗鼠，抗山羊/绵羊等生物素二抗及荧光抗体（FITC、罗达明等）。
⒊ 染料：苏木精，伊红，克紫，硫堇，焦油紫，硝酸银等。
⒋ 常用试剂：牛血清白蛋白，Triton-X-100等。
⒌呈色剂：二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB），四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB），葡萄糖氧化酶等。
⒍ 追踪剂：HRP，WGA，PHA-L等。
〔动物〕
根据实验要求、目的不同选择不同的动物，常用的实验动物为大鼠（SD、Wister）。
三、【实验方法与步骤】
⒈ 动物与材料制备
⑴ 用SD成年雄性大鼠，体重180～230克，置于温暖（20℃）安静的环境饲养48h后使用。
⑵ 用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物，并固定在定位仪上。
⑶ 将示踪剂（30% HRP或2%WGA）0.1μl 定位注入大鼠脑内某一核团（杏仁核簇、下丘脑或孤束核等）动物存活48h。
⑷ 将9%NaCl (5.5ml/kg 体重) 注入尾静脉，2h后，重新深麻动物， 用常规方法灌注固定动物并立即取脑。
⑸ 将脑组织置于含30%蔗糖的PBS液中，40C 保存，待组织沉底。
⑹ 恒冷箱切片机切片，片厚30μm，收集在冷的0.01 mol/L PBS液中。
⒉ HRP的组织化学显示—TMB法
⑴ 切片在蒸馏水中洗2～3次。
⑵ TMB-钨酸钠反应液中预浸20min，开始加入0.3%H2O2（避光），显示HRP或WGA追踪剂。
⑶ 结束反应后，用0.1 mol/L PBS洗3～6次，每次2～4min。
⑷ 在含0.05%DAB、0.02%氯化钴和0.01%H2O2 ( 0.1mol/L PBS 配制， pH7.4)中加强，37℃，10min，反应产物为黑色。
⒊ 免疫组化染色步骤
⑴ 0.01 mol/L PBS液中洗涤3次，每次10min。
⑵ 用0.3%过氧化氢-甲醇室温中处理切片5～30min，封闭内源性过氧化物酶。
⑶ 充分洗涤后，入0.01 mol/L PBS洗3次，每次10min。
⑷ 血清白蛋白中孵育30min，减少非特异性反应。
⑸ 0.3% Triton-X-100中作用20min，增加细胞膜的通透性，用0.01 mol/L PBS洗3次，每次10min。
⑹ 同时加兔抗Fos蛋白和鼠抗GFAP抗血清，在4℃中孵育48h或室温24h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min，振洗。
⑺ 生物素标记的羊抗兔IgG和驴抗鼠IgG (根据公司的说明，选择适宜的稀释度)室温中孵育2h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min。
⑻ ABC复合物(根据公司的说明，选择适宜的稀释度)孵育2h，用0.01 mol/L PBS洗3次，各10min。
⑼ 蒸馏水迅速冲洗3次，进行葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺加强法反应，呈深蓝色。
⑽ 选取呈色好的切片，漂洗后再加入兔（或鼠）抗TH抗血清，4℃中孵育48h或室温24h，用PBS洗3次，各10min，振洗。
⑾ 生物素标记的羊抗兔（或驴抗鼠）IgG室温中孵育2h，用PBS洗3次，各10min。
⑿ ABC复合物孵育2h（室温），PBS洗3次，各10min。
⒀ 蒸馏水迅速冲洗3次，进行葡萄糖氧化酶-DAB棕色法呈色。
⒁ 呈色的切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封片，光镜下观察并摄像。
⒋ 对照实验
⑴ 空白对照：用缓冲液替代第一抗体是最常用的空白对照，染色结果应为阴性。
⑵ 替代对照：用制备第一抗体相同种属动物的正常血清替代一抗或用二抗相同种属动物的正常血清替代桥抗体，染色结果应为阴性。
⑶ 自身对照：用同一组织切片与靶抗原无关的其它结构作对照。阳性与阴性结构在同一视野中，相互印证。
⑷ 阳性对照：同时染色已知靶抗原阳性标本，以排除操作过程失误所致的假阴性。
⑸ 吸收对照：用几倍甚至10倍于抗体浓度的抗原与抗体溶液混合，后将此液过滤，并用于对切片反应，若结果为阴性，说明抗体是特异性的。
四、【实验结果分析与处理】
（一）对染色结果的分析
一般认为在严格控制染色条件、选择特异性抗体等条件下，所得的阳性结果才有积极意义。而所得结果为阴性时，不一定意味着该物质或抗原不存在，即不能排除实验过程所致的抗原丢失或抗体选择不当等引起的假阴性。结果分析首先从切片质量开始，判断固定是否合适、切片是否平滑、非特异性着色强弱等，再从低倍至高倍顺序观察实验标本，预期阳性部位是否被染色，不该含此类物质的部位是否阴性等。同时应结合对照实验做出正确的判断。
（二）假阳性及其处理
组织成分与各种染色试剂及抗血清之间的非特异结合称为假阳性，其主要原因和处理方法如下：
⒈ 内源性过氧化物酶活性：用80%甲醇（0.01mol/l PBS 缓冲液配置）+ 0.3% H2O2孵育标本15～20min，能抑制此假阳性。
⒉ 第一抗体不纯：抗体不纯是指抗体含有杂质抗体或血清。其非特异抗体吸附到组织细胞上造成假阳性。去除方法：一是尽可能高的稀释抗体，减低非特异抗体的浓度；二是一抗孵育之后用PBS充分冲洗；三是在加一抗前加正常血清，以封闭非特异结合位点。
⒊ 第二抗体：将IgG从血清中分离出来，其中同时存在四种成分：一是特异性抗IgG；二是作为抗原的IgG不纯所产生的非特异性抗IgG；三是供体血循环中其它的IgG；四是非IgG蛋白。除特异性抗IgG外，其它成分可以通过与组织结构的特异性交叉反应或通过非特异的疏水键与组织细胞结合，产生非特异性染色。去除方法基本同（2）。
⒋ 游离醛基：醛类固定的组织切片上，存在游离醛基，它能与蛋白质（含IgG）间非特异性结合，导致假阳性。用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育切片，可封闭。
（三）阳性染色的确认与数据采集
阳性染色结果一般应具备以下特征：
⒈ 染色均匀，胞核、胞浆、胞膜、纤维、突起等形态结构完整。
⒉ 阳性染色产物的特异性分布，有核团或细胞学定位差别。
⒊ 多重染色的阳性产物可以清晰分辨。如：神经元Fos阳性胞核是深蓝色，TH（或VP）阳性胞浆呈棕色，HRP示踪剂产物是棕色胞浆内的黑色的颗粒状，GFAP阳性胶质细胞呈深蓝色。（见图20-1-1）
⒋ 阳性结果在光镜下观察，根据需要摄像或半定量分析。
五、【注意事项】
⒈ 选择适当的固定液，掌握恰当的固定时间和方法，最大限度地保持组织的细胞结构和酶的活性。
⒉ 实验组和对照组要合理配伍和处理。
⒊ 动物标本或切片尽量使用新鲜的，需长时间保存则存放在-70℃冰箱。
⒋ 抗体按照说明保存，并选择合适的工作浓度使用，忌反复冻融。
⒌ 选择适当的孵育时间与温度，切片应充分与抗体接触，防止抗体风干、流失。
⒍ 切片每次漂洗要彻底，防止交叉反应。
⒎ 呈色反应过程应随时在镜下观察反应结果并及时终止反应。
⒏ 第一、二次的呈色不宜过深，以免影响结果的观察。
⒐ 切片要晾干后再脱水，透明，封片。
